Реакция иммунофлюоресценции РИФ

В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.

Они применяются:

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюоресцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ:

1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.);

2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ к искомому антигену;

3) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.

Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию метки (рис.34).

Компоненты непрямой РИФ, предназначенной для экспреесс-диагностики гриппа А:

1) исследуемый материал смыв с носоглотки больного с подозрением на грипп;

2) специфическая антисыворотка с антителами против вируса гриппа А;

3) антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулина), меченная флюорохромом;

4) изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем – меченной антиглобулиновой сывороткой.

Иммунные комплексы АГ-АТ – меченные АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.

Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Для серологической диагностики гриппа А,то есть для определения антител против вируса гриппа А в сыворотке крови с помощью непрямой РИФиспользуют гриппозный диагностикум (антиген вируса гриппа А). Серодиагностика вирусных инфекций в основном носит ретроспективный характер и применяется для подтверждения диагноза и эпидемиологического анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ — инфекции)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).

К преимуществам ИФА следует отнести:

— простота методов оценки реакции;

— стабильность конъюгатов;

— легко поддаётся автоматизации.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

А) конкурентный тип

Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;

4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;

5) фосфатно – солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

— положительная (сыворотка с HBs Ag);

— отрицательная (сыворотка без HBs Ag).

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 1 час при 37°С.

3. Отмывание лунок.

4. Внесение конъюгата.

5. Инкубация 1 час при 37°С.

6. Отмывание лунок.

7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Реакция протекает в три фазы:

1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ — HBs Ag — anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

В) непрямой тип

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.

Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.

Компоненты:

1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);

2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;

3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);

4) ОФД;

5) фосфатно-солевой буфер;

6) контрольные сыворотки:

— положительная;

— отрицательная.

Ход работы:

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 30 минут при 37°С.

3. Отмывание.

4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.

5. Инкубация 30 минут при 37°С.

6. Отмывание.

7. Внесение ОФД.

Реакция протекает в 3 фазы:

1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ — АТ к ВИЧ).

2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.

3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.

Сифилис – одно из самых опасных венерических заболеваний, возбудителем которого является бледная трепонема. Вредоносные микроорганизмы могут проникнуть в организм после незащищенного полового акта и бытовым путем. Сегодня анализ крови на сифилис является базовым, его проводят при медицинском профосмотре, а также требуют при устройстве на работу в некоторые организации.

Кроме того, процедура в обязательном порядке назначается беременным женщинам. Самым эффективным методом диагностики этого заболевания является лабораторное исследование венозной крови. Как называется анализ на сифилис, как к нему подготовиться и насколько достоверно такое исследование?

Показания к проведению

Условно все анализы на сифилис называются ОРС. Аббревиатура расшифровывается как отборная реакция на сифилис. Под этим термином подразумевается диагностическое лабораторное исследование, в ходе которого можно обнаружить антитела к фосфолипидам, формирующиеся из-за поражения клеток и тканей, вызванного бледной трепонемой.

Проверка на сифилис чаще всего проводится людям с подозрением на наличие заболевания, а также пациентам, которым назначено полноценное медицинское обследование. При этом стоит учитывать, что исследование предполагает проведение дополнительного анализа на ВИЧ и гепатит.

И также тестирование на сифилис назначается в следующих случаях:

  • постановка женщины на учет при беременности;
  • если пациент выступает как донор;
  • при пребывании в местах лишения свободы;
  • если предыдущие анализы показали присутствие в крови пациента наркотических веществ;
  • длительное увеличение размера региональных лимфатических узлов;
  • продолжительная лихорадка неясной этиологии;
  • предыдущее тестирование показало присутствие бледной трепонемы;
  • если у человека был половой контакт с зараженным сифилисом;
  • возникновение сомнительной симптоматики, указывающей на развитие заболевания (первый признак сифилиса – появление высыпаний в области половых органов).

И также сдать биоматериал на исследование необходимо, если человек хочет устроиться на работу в некоторые учреждения:

  • воинская часть;
  • больницы, поликлиники, лаборатории;
  • кафе, рестораны, столовые и другие места общественного питания;
  • школы, детские садики.

Регулярное тестирование нужно проводить пациентам, у которых уже диагностировано данное заболевание. В этом случае анализ назначается для оценки эффективности выбранной схемы лечения.

Методы диагностики

Для выявления сифилиса или подтверждения его отсутствия используются разные методы диагностики и типы анализов. Наиболее информативным и точным методом исследования является изучение венозной крови пациента. Забор биоматериала может осуществляться как из вены, так и из пальца (в зависимости от типа лаборатории и методики).

В некоторых случаях обнаружение бледной трепонемы может осуществляться при помощи других образцов:

  • ликвор (секрет, продуцирующийся в спинномозговом канале);
  • содержимое лимфоузлов;
  • ткани изъязвлений.

Диагностика сифилиса происходит одновременно несколькими методами

Каждое из существующих тестирований отличается информативность, имеет определенные преимущества и недостатки. Решать, каким именно способом сдавать анализ на сифилис, должен только лечащий врач, учитывая индивидуальные особенности пациента.

Клинический анализ крови (РВ/RW)

Самый распространенный способ диагностирования сифилиса – проведение общего анализа крови. Данная иммунологическая процедура называется реакцией Вассермана. Тестирование относится к классу РСК (реакция связывания комплемента) и впервые было проведено в 1906 году.

Оно базируется на способности венозной крови сворачиваться и образовывать комплекс при взаимодействии с антигенами. Современные методы РСК в выявлении сифилитической инфекции существенно отличаются от классической RW. По сути, эти процедуры имеют только одинаковое название.

Постановка диагноза осуществляется с учетом того, присутствуют ли в исследуемом образце антитела, свидетельствующие о наличии заболевания. Несмотря на то что тестирование является максимально информативным и достоверным, нельзя исключать вероятности проявления ложноположительной реакции.

Ложноположительный ответ связан с тем, что в человеческом организме изначально присутствует кардиолипин, однако обычно иммунная система не создает антитела против родного антигена. Но медицинская практика показывает, что исключения случаются. Чаще всего это происходит, если человек недавно перенес вирусное заболевание тяжелой формы или столкнулся со следующими заболеваниями:

  • воспаление легких;
  • дисфункция почек;
  • гематологические заболевания.

И также ложноположительная реакция нередко проявляется во время беременности, что сопровождается сильным ослаблением иммунной системы. Если специалист подозревает, что тестирование показало ложноположительный результат, пациенту назначаются дополнительные расширенные анализы.

Реакция микропреципитации (РМП)

Сегодня этот метод обнаружения сифилиса в крови постепенно вытесняет все остальные способы диагностики заболевания. Реакция микропреципитации – исследование, которое по механизму проведения схоже с реакцией Вассермана. Но в то же время процедура отличается простотой и большей информативностью – если образец заражен, в нем обязательно появятся белые хлопья.

Еще одно преимущество РМП – кровь на анализ берется не из вены, а из пальца. Если с момента заражения прошло более 30 дней, методика гарантированно покажет положительный результат. Риск получения ложноположительных сведений при таком тестировании сведен к минимуму и может проявиться только на фоне таких нарушений:

  • обострившиеся инфекции;
  • недавно перенесенный инфаркт;
  • кровоизлияние в мозг;
  • сильная интоксикация организма.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Еще один распространенный метод диагностирования сифилиса, осуществляемый при помощи венозной крови. Чтобы РИБТ дала правильный результат, за несколько дней до сдачи биоматериала необходимо исключить прием антибактериальных препаратов.

Это связано с тем, что большая часть антибиотиков при попадании в организм блокируют и подавляют деятельность бледных трепонем. Положительный ответ РИЮТ проявляется примерно с середины второй стадии заражения и может сохраняться даже после окончания лечения.

Так под микроскопом выглядит возбудитель сифилиса – бледная трепонема

РИФ и РИТ исследование

Многие пациенты сталкиваются с такой проблемой, что даже после окончания лечения сифилиса анализ показывает положительный результат. Выявить и оценить достоверную клиническую картину можно при помощи сверхчувствительных тестов РИФ (реакция иммунофлюоресценции) и РИТ (реакция иммобилизации трепонем).

Эти анализы отличаются сложностью и продолжительностью, их возможно провести только при наличии дорогостоящего современного оборудования.

РИФ анализ при сифилисе показывает положительную реакцию спустя 2 месяца после инфицирования. Если же тестирование показало отрицательный результат, значит, пациент здоров. Чаще всего РИФ и РИТ анализы делаются при положительной реакции микропреципитации для подтверждения достоверности результата.

ИФА и РПГА

К наиболее информативным и самым точным методам диагностики сифилиса относят тесты ИФА (иммуноферментный анализ) и РПГА (реакция пассивной гемагглютинации). Основное преимущество этих исследований – они готовятся в течение короткого периода времени.

РПГА дает положительный ответ уже через месяц после инфицирования и чаще всего проводится одновременно с нетрепонемными и трепонемными тестами. Обычно при помощи РПГА диагностируется первичная форма заболевания, сопровождающаяся возникновением язв и сыпи. Поскольку РПГА длительное время показывает положительную реакцию, методику редко применяют для оценки эффективности назначенной схемы лечения.

Иммуноферментный анализ может показать присутствие вредоносных микроорганизмов уже через 3 недели после инфицирования. Ложноположительный результат проявляется редко и чаще всего связан с системными патологиями или дисфункцией обменных процессов.

Подготовка к проведению процедуры

Провести тестирование на сифилис можно в любой лаборатории Москвы и других крупных городах. Чаще всего назначение на исследование выписывается врачом-венерологом. При желании тестирование можно провести и анонимно, без направления.

Чтобы результаты анализа были достоверными, перед процедурой необходимо придерживаться правил подготовки:

  • поскольку забор биоматериала осуществляется натощак, перед процедурой запрещено есть. Единственное, что допускается – пить воду;
  • за 3 суток до анализа рекомендуется отказаться от потребления жирной пищи и алкогольной продукции;
  • если пациент принимал антибиотики, анализ можно проводить только спустя неделю после окончания лечения.

Откуда берут кровь на сифилис, зависит от типа назначенной процедуры, но в большинстве случаев забор биоматериала осуществляется из вены. Время расшифровки результата зависит от типа лаборатории, обычно лаборанты предоставляют результаты уже через 1–2 дня. И также в некоторых клиниках предоставляется услуга экстренной проверки, когда результаты выдаются на руки уже через несколько часов после сдачи крови.

Стоит учитывать, что анализ на сифилис действителен на протяжении 3 месяцев, по истечении этого времени тестирование нужно проводить повторно

Расшифровка результатов

Большинство клинических лабораторий выдает бланк с результатами на руки пациенту. Полученный бланк необходимо отнести врачу, назначившему исследование, который, отталкиваясь от полученных сведений, оценит общую клиническую картину. Может ли пациент самостоятельно прочесть результаты тестирования?

Изучая описанные сведения, можно сделать только предположительный вывод, но окончательный диагноз ставится исключительно квалифицированным специалистом. При профилактическом осмотре или экспресс-диагностике чаще всего назначаются нетрепонемные тесты. Результат тестирования обозначается таким образом:

При этом стоит учитывать, что полученный результат может быть как ложноположительным, так и ложноотрицательным. Если следы сифилиса у пациента отсутствуют, и у человека не было незащищенных половых актов с новыми партнерами, врач может истолковать ложный результат как верный.

Сифилис – опаснейшее заболевание, которое медленно и бессимптомно развивается и ведет к тяжелым осложнениям вплоть до гибели пациента. Именно поэтому проводить тестирование на присутствие заболевание время от времени рекомендуется каждому человеку. При своевременном обнаружении болезни терапия будет более эффективной и сведет к минимуму риск развития плачевных последствий.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — серологическая реакция, позволяющая выявить антитела к известным антигенам. Метод заключается в микроскопии окрашенных мазков.

Данную реакцию используют в иммунологии, вирусологии и микробиологии. Она позволяет определить наличие вирусов, бактерий, грибов, простейших и ИКК. РИФ очень широко применяется в диагностической практике для обнаружения вирусных и бактериальных антигенов в инфекционном материале. Метод основан на способности флюорохрома вступать в связь с белками, не нарушая при этом их иммунологической специфичности. В основном применяется при диагностике инфекций мочеполовых путей.

Различают следующие методы проведения реакции иммунофлюоресценции: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод заключается в окрашивании материала флюорохромами. Благодаря способности антигенов микробов или тканей светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа, они определяются как клетки с ярко окрашенной каймой зеленного цвета.

Непрямой метод заключается в определении комплекса антиген+антитело. Для этого опытный материал обрабатывается антителами антимикробной кроличьей сыворотки, предназначенной для диагностики. После того как антитела свяжутся с микробами, их отделяют от не связавшихся и обрабатывают антикроличьей сывороткой, помеченной флюорохромом. После этого комплекс микроб+анимикробные антитела+анитикроличьи антитела определяется с помощью ультрафиолетового микроскопа также, как и при прямом методе.

Реакция иммунофлюоресценции незаменима при диагностике сифилиса. Под воздействием флюорохрома возбудитель сифилиса определяется как клетка с желто-зеленой каймой. Отсутствие свечения означает, что пациент не заражен сифилисом. Этот анализ часто назначается при положительной реакции Вассермана. Данный метод очень эффективен при диагностике, так как позволяет определить возбудителя на ранних стадиях заболевания.

Кроме того, что РИФ позволяет диагностировать сифилис, его также применяют для определения наличия таких возбудителей как хламидии, микоплазма, трихомонады, а также возбудителей гонореи и генитального герпеса.

Для проведения анализа используют мазки или венозную кровь. Процедура взятия мазка совершенно безболезненная и не представляет никакой опасности. К сдаче данного анализа необходимо подготовиться. За двенадцать часов до него не рекомендуется пользоваться средствами гигиены, такими как мало или гели. Также иногда по показаниям врача проводиться провокация. Для этого рекомендуют прием острой пищи или алкоголя или проводится инъекция провоцирующего вещества, например гоновакцина или пирогенал. Помимо этого промежуток между приемом антибактериальных препаратов и сдачей анализа должен быть не менее четырнадцати дней.

При оценке результатов следует учитывать тот факт, что свечение наблюдается не только у живых бактерий, но и у мертвых, особенно это относится к хламидиям. После курса антибиотиков мертвые клетки хламидий также обладают свечением.

При правильной подготовке пациента и соблюдении техники взятия мазка, данный анализ позволяет определить заболевания на ранних стадиях, что очень важно для своевременного лечения. Положительными сторонами данного метода является короткие сроки получения результата, простота выполнения и небольшая стоимость анализа.

К недостаткам можно отнести то, что для проведения анализа необходимо достаточно большое количество исследуемого материала. Кроме того, оценку результатов может проводить только опытный специалист.

Оглавление:

Прямые способы

Микроскопия в темном поле

Бледные трепонемы не могут расти на питательных средах и не визуализируются под световым микроскопом. Так как обнаружение патогена с помощью обычной микроскопии невозможно, применяют специальный микроскоп с темным полем, где возбудитель виден в виде спирали на темном фоне.

Для проведения микроскопии забирается биоматериал с подозрительного на заболевание очага. Микроскопия в темном поле – это возможный способ оценки кожных поражений, таких как шанкр первичного сифилиса или кондилома вторичного сифилиса. Если материал макулопапулезного очага сухой, исследуют аспират лимфатического узла.

Отрицательный результат не исключает патологический процесс, статистически выявление возбудителя возможно только в 80%.

ПЦР-диагностика

Реакция, направленная на многократное увеличение ДНК бледной трепонемы, позволяет сделать вывод об инфицировании сифилисом или об его отсутствии.

Биоматериал для анализа может быть любым: кровь, содержимое сифилида, спинномозговой жидкости и пр. Тест подходит для инкубационного периода.

ПЦР полностью специфична.

Непрямые серологические анализы на сифилис: трепонемные и нетрепонемные тесты

Серологические анализы (КСР или комплекс серологических реакций) считаются наиболее распространенным способом для диагностики всех стадий сифилиса. Выделяют следующие реакции:

  • агглютинации;
  • преципитации;
  • иммунофлюоресценции;
  • иммуноферментный анализ и пр.

Также серологические анализы на сифилис подразделяют на трепонемные и нетрепонемные.

Нетрепонемные

При подозрении на приобретенный сифилис выполняют скрининговое тестирование, для чего используют нетрепонемные тесты , определяющие антитела к липоидным антигенам тканей хозяина или возбудителя в разнообразных модификациях. В РФ рутинно выполняют реакцию микропреципитации (РМП), которая позволяет выявить антитела к поврежденным патогеном клеткам в крови. Достоверность скрининга высокая, но специфичность невелика, поэтому тестирование подходит для первичного массового обследования в превентивных целях.

Чувствительность экспресс-тестов оценивается в 78-86% для выявления первичного сифилиса, 100% для вторичного сифилиса и 95-98% для выявления третичного сифилиса.

Специфичность — от 85-99%, иногда- менее, что встречается при следующих состояниях:

  • гестация;
  • менструация;
  • онкология;
  • заболевания соединительной ткани;
  • вирусные заболевания;
  • болезни печени;
  • вакцинация;
  • «свежий» ИМ;
  • сыпной тиф и пр.

Помимо этого, избыток жиров в рационе, употребление спиртосодержащих напитков и прием некоторых лекарств могут привести к ложноложительным заключениям.

Результаты скринингового тестирования становятся положительными через 1-2 недели после образования шанкра. Нетрепонемные тесты дают отрицательный ответ через некоторое время после лечения. При ВИЧ-статусе нетрепонемные антитела могут выявляться длительно, иногда на протяжении всей жизни (что подтверждается результатами соответствующего рандомизированнного исследования).

Другие разновидности нетрепонемных анализов: VDRL, плазмореагиновый тест (RPR) , проба с толуидиновым красным, реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк).

Реакция Вассермана (RW)

Связывание комплемента – ответ иммунной системы на инфицирование, результат варьируется от отрицательного (ставится «-«), до резко положительного «++++» или 4 плюса.

В начальной стадии первичного сифилиса RW отрицательна.

Трепонемные

Из-за возможности ложноположительных результатов для подтверждения любого положительного или сомнительного результата нетрепонемного анализа, используют трепонемные тесты:

Трепонемные тесты не используются для оценки эффективности терапии.

РИФ на определение трепонемных АТ класса IgG применяют после положительного результата экспресс-анализов (чувствительность 84% для первичного сифилиса и 100 % при других стадиях, специфичность 96%). Для диагностики у новорожденных не применимы.

В некоторых лабораториях используют «обратные» скрининговые исследования.

CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США) рекомендует традиционные исследования, с проверкой количественными нетрепонемными тестами, при положительном результате проводится лечение.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

На собранный материал наносят сыворотку с мечеными флюорохромом антителами, специфичными к антигену бледной трепонемы, возбудитель притягивает к себе иммунные комплексы, из-за чего начинает светиться в люминесцентном микроскопе.

Реакция пассивной гемоагглютинации или РПГА

До появления гемагглютинации (склеивания) эритроцитов с момента внедрения бледной трепонемы должно пройти не менее 4 недель.

Подготовленные эритроциты с фиксированными белковыми фракциями патогена взаимодействуют с плазмой, если есть антитела к сифилису, происходит реакция.

Подходит для подтверждения любой стадии заболевания.

Иммуноферментный анализ

В основу положена реакция антиген-антитело. Выявляются антитела различных классов, которые можно оценить количественно.

Полученные результаты позволяют судить о длительности патологического процесса, успешности проводимого лечения, иммунологическом статусе, активности возбудителей.

Иммуноблоттинг – разновидность ИФА, применяют для углубленной диагностики при всех сомнительных результатах.

Чувствительность и специфичность близка к 100%, на сегодняшний день ультрачувствительный метод идентификации белков.

РИБТ

Способ основан на реакции антиген-антитело. Антигеном служат бледные трепонемы, культивируемые в тестикулах кролика. При взаимодействии с антителами зараженного человека, патогены утрачивают подвижность. Реакция оценивается с помощью микроскопии в темном поле.

Обратите внимание

РИБТ в настоящее время применяют из-за трудоемкости реже, но анализ может быть полезен для решения спорных вопросов (ложноположительные реакции на сифилис).

Дифференциальная диагностика

Наибольшую сложность представляет диагностика третичного сифилиса, что обуславливается симптомами со стороны сердечно-сосудистой и нервной системы, а также проявлениями со стороны кожного покрова.

Пациенты обязательно должны быть обследованы на , и .

Перечислим заболевания, с которыми проводят дифференциальную диагностику при сифилисе:

  • дерматологические проявления ;
  • генитальные бородавки ();
  • донованоз;
  • венерическая лимфогранулема;
  • вирус ;
  • фрамбезия.

С чего начинается диагностика сифилиса

Изначально проводится беседа с пациентом, во время которой уточняются детали: когда был подозрительный половой контакт и какие есть жалобы.

После сбора анамнеза переходят к физикальному осмотру, особое внимание уделяется области гениталий и ануса, слизистым оболочкам и лимфатическим узлам. Предварительный диагноз уже может быть установлен. Окончательная верификация происходит с помощью лабораторных анализов.

Если сказать просто о сложном, то одни анализы выявляют возбудителя сифилиса, а другие отражают реакцию организма на внедрение бледной трепонемы.

Для установки окончательного диагноза РПГА следует дополнить 1 трепонемным и 1 нетрепонемным анализом.

Диагностика сифилиса у беременных

Проводятся обязательное исследование на сифилис несколько раз в течение беременности.

Направление на анализ КСР выдается во время первого визита женщины в консультацию, и за время беременности трижды выполняется обследование. Пациентки из высокой группы риска с отягощенным анамнезом: , асоциальные, зависимые и пр. требуют особенно пристального внимания.

Если результаты анализа положительные, проводят более глубокую диагностику, и по показаниям назначают лечение, которое зависит от стадии и клинических проявлений.

Диагностика врожденного сифилиса

Большинство детей с рождаются у нелеченных матерей, либо получивших терапию слишком поздно.

Трепонемные тесты с использованием неонатальной сыворотки не рекомендуются из-за пассивного переноса антител IgG. Все дети, рожденные от матерей с сифилисом, должны обследоваться с помощью количественного нетрепонемного серологического теста (RPR или VDRL), выполненного с использованием сыворотки крови новорожденного.

Как трактовать результаты серологических исследований

Реакция микропреципитации, РИФ и РПГА отрицательны – норма, положительны – подтверждение сифилиса.

Реакция микропреципитации отрицательна, остальные положительны – сифилис в анамнезе после проведения специфической терапии, либо поздняя стадия.

Отрицательная РИФ при положительных РПГА и реакции микропреципитации – результат вызывает сомнения, повторная комплексная оценка.

Отрицательный результат РИФ и микропреципитации, но положительная РПГА – состояние после успешной антибиотикотерапии либо ложноположительный результат.

Положительная РИФ при отрицательных РПГА и реакции микропреципитации – ранняя стадия, проведенное лечение или недостоверность результата.

Положительная реакция микропреципитации, не подтвержденная ни РПГА, ни РИФ – отсутствие сифилиса.

Инструментальное исследование при сифилисе

Инструментальная диагностика проводится в зависимости от вовлеченности органов. Например, гранулематозное поражение печени можно увидеть при брюшной полости.

У пациентов с третичным сифилисом может показать дилатацию аорты. Линейная кальцификация по ходу аорты свидетельствует в пользу сифилитического аортита.

Открытая еще в 1942 году Кунсом, реакция иммунофлуоресценции не является новым методом исследования. Однако появление гибридомных технологий, которые позволили получить моноклональные антитела, дало «вторую жизнь» этой реакции, поскольку их использование позволило в несколько раз увеличить чувствительность данной реакции и ее специфичность.

И сегодня мы расскажем вам в подробностях про реакцию прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) как метод диагностики Кунса для взрослых мужчин и женщин при беременности.

Что такое реакция иммунофлуоресценции

Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале. Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.

Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.

Кому ее назначают

Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:

  • наличие в организме вируса ;
  • заражение сальмонеллой;
  • существование в организме определенных антигенов;
  • выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
  • диагностика вирусных болезней у животных.

Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.

Цели проведения

Поскольку данный метод диагностики имеет множество преимуществ, к которым следует отнести его высокую результативность, быстроту проведения и получения результата, а также отсутствие большого количества противопоказаний, с его помощью определяется наличие в организм вирусных инфекций. Поэтому назначать данный анализ могут как для постановки, так и для уточнения диагноза, на основании которого назначается схема лечения.

Проведение процедуры не вызывает неприятных ощущений, для нее необходимо получить материал для анализа, который берется из любой жидкости организма: слюны, мокроты, соскоб с поверхности слизистых оболочек. Также может для проведения анализа браться кровь. Частоту проведения реакции иммунофлуорсценции назначает лечащий врач, которому необходимо получить данные по динамике протекающих в организме процессов.

Поскольку вреда как для организма, так и для общего самочувствия человека данный анализ не несет, назначаться он может по необходимости.

Виды такой процедуры

Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.

К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:

  1. — один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
  2. ДНК-диагностика — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
  3. иммунохромотография — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.

Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.

Показания к проведению

Реакция иммунофлуоресценции может назначаться для выявления в организме любого вида патологической среды.

Хламидии, трихомонады, гонококки и , а также лямблии всех видов определяются при проведении данного вида диагностики. и , и другие болезни также требуют проведения РИФ. Назначение врача для ее осуществления обязательно.

Противопоказания для проведения

Поскольку для проведения данной реакции в качестве исследуемого материала требуется любой вид жидкости организма, взятие их обычно не составляет трудностей и противопоказаний для осуществления реакции иммунофлуоресценции не существует. Однако при беременности и у детей до 6 месяцев взятие материала для исследования проводится с максимальными предосторожностями.

Отсутствие противопоказаний позволяет осуществлять проведение данного вида диагностики при назначении врача всем пациентам. Безопасность ее гарантируется использованием дезинфицированным инструментом и одноразовыми шприцами.

Подготовка к процедуре

Особенностей взятия материала для проведения данного анализа не существует. Кровь для него берется натощак, чтобы не было повышенного содержания в ней веществ, которые может изменить истинные показания и дать ложную картину.

Как проходит забор анализов

Поскольку особой подготовки для проведения анализа не требуется, исключается только прием пищи за 12 часов до ее проведения и отсутствие применения лекарственных препаратов, выполняется взятие исследуемого материала как обычный процесс взятия жидкости организма на анализ.

Субъективные ощущения во время процедуры могут различаться в зависимости от чувствительности.

Расшифровка результатов

Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:

  • степень интенсивности флюоресценции;
  • оттенок флюоресценции;
  • периферический характер процесса свечения объекта;
  • характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.

Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд

няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.

По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.

Средняя стоимость

Цена проведения реакции иммунофлуоресценции зависит от места ее проведения и уровня медицинского учреждения,а также квалификации проводящего анализ специалиста. Сегодня стоимость колеблется от 1280 до 2 160 рублей.

Более подробно о иммунологических реакциях поведает видео ниже:

Лабораторная диагностика использует сразу несколько тестов на сифилис для получения максимально точного результата. Это занимает больше времени, но зато даёт наиболее точный ответ.

Чаще всего результат анализа РИФ представляют цифрами. Расшифровка имеет следующие обозначения:

Результат РИФ на сифилис также представляется в процентном варианте, который зависит от количественного показателя связанных бактерий:

  • при отрицательном результате иммобилизация до 20%;
  • при слабоположительном результате иммобилизация варьирует от 20 до 50%;
  • при положительном результате иммобилизация выше 50%.

Если результат выдал положительный ответ, то это констатирует наличие заболевания.

Если результат слабоположительный , то это указывает на единичное количество остаточных антител в крови.

Отрицательный результат говорит об отсутствии бледной трепонемы, а это означает, что пациент здоров.

Опытные врачи нашей клиники проведут диагностику сифилиса быстро и с высокой точностью показаний. Мы социально ориентированы на все слои населения, поэтому стоимость анализа РИФ недорогая . Цена представлена в таблице на нашем сайте.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) — метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген — антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

22. Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакции антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация:

Конкурентный (в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог)

Неконкурентный (Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела))

Прямой и непрямой

1.сыворотку,содержащую смесь ат, инкубируют с аг, фиксированным на твердом субстрате.

2.ат,не связывающие аг, удаляют многократным промыванием.

3. вносят меченную ферментом антисыворотку к ат, связывавшим аг

4.определят количество фермента-маркера, связавшегося с ат

Непрямой:

Ат-положительная сыворотка

1.специфические ат в иследуемой сыворотке связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. специфичные ат, меченные ферментом,не взаимодействуют со связанным аг-содержание маркера в субстрате низкое

Ат-отрицательная сыворотка

1. Неспецифические ат в исследуемой сыворотке не связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. Специфические ат, меченные ферментом, взаимодействуют, с фиксированным аг –содержание маркера высокое

Наиболее распространен твердофазный ифа, при котором один из компонентов иммунной реакции(антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используется микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови, меченную ферментом, и смесь растворов для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем-смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Применение: для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

23. Серологическая реакция — реакция, с помощью которой исследуется реакция антигена (микроба, вируса, чужеродного белка) с антителами сыворотки крови.

Серологические исследования — это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:

1. Реакция агглютинации.

2. Реакция преципитации.

3. Реакция нейтрализации.

4. Реакция с участием комплемента.

5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — это метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. Метод основан на микроскопии окрашенных специальным образом мазков и других образцов тканей. Применяется в основном для обнаружения возбудителей инфекций мочеполовых путей, таких как хламидии, микоплазмы, трихомонады, гонококки, вирус герпеса и пр.

Существует два типа реакции иммунофлюоресценции — прямая и непрямая.

  • Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — в этом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования.
  • Непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ) — в этом случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса антиген-антитело, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к конкретным антителам.

Материалом для исследования служат мазки. Техника взятия мазков не представляет опасности для здоровья и является безболезненной. Реакцию оценивают с помощью люминисцентного микроскопа. Если тестируемые возбудители присутствуют, то они светятся, как светлячки в объективе микроскопа.

Этот метод не зависит от возможного изменения тинкториальных (способности окрашиваться) свойств микроорганизма в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является важнейшим скрининговым методом диагностики урогенитального хламидиоза (в медицине под скринингом понимают проведение простых и безопасных исследований большим группам населения с целью выделения групп риска развития той или иной инфекции).

РИФ при правильной подготовке пациента, соблюдении правил взятия материала и постановки реакции является высокочувствительным и специфичным методом диагностики урогенитального хламидиоза и позволяет выявлять возбудителя у 80–90% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (до 30–50 минут) и визуально котролировать качество взятия материала для исследования.

В целом, методика РИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичности, но требует исполнения опытным, компетентным лабораторным работником.

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.

Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.

Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной не флюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.

Работа № 3

Иммуноферментный анализ (ифа)

Широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченных ферментом специфических антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления не связавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антиглобулиновых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных при постановке ИФА.

*

+

Специфические Исследуемый материал- Специфические антитела Субстрат

антитела возбудитель с пероксидазой для пероксидазы

*

+

Исследуемая АГС, меченая

сыворотка пероксидазой Субстрат для

Специфический пероксидазы

антиген

Контроль:

позитивный — иммунная сыворотка, меченная пероксидазой + субстрат — 2 лунки;

негативный — нормальная сыворотка + субстрат — 2 лунки.