Онкобелок р16

Определение онкопротеина р16ink4a

Иммуноцитохимическое исследование, позволяющее выявить экспрессию белка р16 (p16INK4a) на поверхности эпителиальных клеток. Белок р16 является биологическим маркером начала канцерогенеза – повышение его экспрессии наблюдается при предраковых изменениях и может рассматриваться как непрямой маркер активной онкогенной экспрессии ВПЧ высокого онкологического риска (выявляется при переходе ВПЧ из эписомальной формы в интегрированную). Определение экспрессии белка р16 позволяет с высокой точностью обнаружить риск развития рака шейки матки, своевременно поставить диагноз и назначить лечение. Определение уровня экспрессии позволяет выявить степень нарушения пролиферации, сопутствующей опухолевому росту, способность опухоли к инвазии и метастазированию.

Синонимы русские

Белок p16INK4a; иммуноцитохимическое исследование.

Синонимы английские

Оncoprotein p16INK4ain; immunocytochemical study.

Метод исследования

Иммуноцитохимический метод + жидкостная цитология.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Аспират из полости матки.

Общая информация об исследовании

Одной из самых современных методик ранней диагностики предраковых состояний является иммуноцитохимическое исследование — определение онкопротеина р16ink4a для оценки потенциала дисплазии эпителия.

Было доказано, что экспрессия онкопротеина р16ink4a связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (по цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL), причем экспрессия онкопротеина р16ink4a не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В норме кодируемый геном-супрессором белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин-зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако при ВПЧ инфекции встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимической реакции.

В то же время, хотя отмечается четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имеется также большое количество ПЦР-позитивных по HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых при последующем гистологическом исследовании отсутствует предрак и рак. Это подтверждается негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4a в диспластических клетках.

В данном исследовании применяется современная технология приготовления цитопрепаратов — жидкостная цитология. Важная особенность метода, повышающая качество исследования: исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства. В последние пять лет в разных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и жидкостной цитологии с использованием для подтверждения диагнозов гистологической экспертизы как «золотого стандарта» и оценки цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System). Метод жидкостной цитологии признан надежным лабораторным тестом, который снижает количество ложноотрицательных результатов, неудовлетворительных для анализа препаратов и время, необходимое цитологу для оценки препарата.

Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки области шейки матки могут не попасть в препарат, подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно снижает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод жидкостной цитологии позволяет исключить эти негативные факторы. Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что при взятии материала можно получить до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований.

Данное обследование может быть применено в диагностике поражения шейки матки, где это является наиболее частым и востребованным методом исследования. Оно может позволить:

  • достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и, соответственно, выбирать более консервативную или более агрессивную тактику лечения;
  • уточнять заключения цитолога — дополнительному исследованию на онкопротеина р16ink4a подлежат все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения-ASCUS) и все изменения железистого эпителия;
  • разрешать спорные вопросы при выявлении гинекологом высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;
  • во многих случаях обоснованно отказаться от биопсии — у большинства пациенток пожилого возраста с цитологической картиной дисплазии на фоне атрофического цервицита обоснованно избирать выжидательную тактику, отказавшись не только от лечения, но и от биопсий, и увеличить интервалы между диспансерными осмотрами; у небольшого числа р16ink4a-позитивных пациенток этой возрастной группы, напротив, обоснованно избрать более активную тактику;
  • определять индивидуальную тактику в отношении пациенток, инфицированных штаммами вируса папилломы человека высокого онкогенного потенциала, если у них нет цитологических и кольпоскопических изменений; у женщин с позитивной ПЦР по HPV выделить группу пациенток, у которых уже инициирован канцерогенез в эпителии шейке матки, и направить на них необходимое лечебное воздействие; соответственно, в более многочисленной группе р16ink4a-негативных женщин необходимо продолжить мониторинг;
  • усовершенствовать мониторинг пациенток, прошедших органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ», добавив определение онкопротеина р16ink4a к рутинному цитологическому исследованию, это позволит у пациенток наибольшего риска повысить чувствительность цитологического исследования и тестировать персистирующую папиллома-вирусную инфекцию до появления морфологических изменений.

Для чего используется исследование?

  • Обследование женщин независимо от наличия или отсутствия патологии шейки матки;
  • обследование женщин и мужчин при подозрении на рак шейки матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы;
  • наличие патологии шейки матки;
  • контроль эффективности лечения патологии шейки матки

Когда назначается исследование?

  • При наличии клинико-анамнестических признаков (эрозия, лабораторно подтвержденное инфицирование ВПЧ), позволяющих заподозрить онкологический процесс в шеечной части матки, мочевого пузыря, прямой кишке;
  • все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения) и все изменения железистого эпителия;
  • при выявлении высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;
  • при наблюдении за пациентками, прошедшими органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ» в целях повышения чувствительности цитологического исследования.

Что означают результаты?

Референсные значения: отсутствие экспрессии белка р16 в клетках эпителия (негативная реакция).

Заключение включает в себя два подраздела: цитологическое описание и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.

Цитологическое заключение интерпретируется в зависимости от выявления онкомаркера р16ink4a. В особенности это относится к дисплазиям шейки матки.

Белок р16(INK4a) осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, препятствуя пролиферации клетки. В норме по механизму обратной связи синтез р16 сдерживается, таким образом, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией.

Достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией, причем экспрессия р16 практически не встречается в плоском эпителии без признаков дисплазии (0-2% случаев).

Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии и выявляется:

  • в 16% случаев при CIN I – плоскоклеточном интраэпителиальном поражении низкой степени тяжести – воспалительные изменения, характерные для инфекции ВПЧ, слабая дисплазия эпителия;
  • в 64% при CIN II — плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени тяжести – умеренная дисплазия эпителия;
  • в 90% случаев при CIN III — тяжелая дисплазия эпителия и внутриэпителиальный рак шейки матки;
  • в 100% при плоскоклеточном раке шейки матки.



Кто назначает исследование?

Гинеколог, онколог.

Также рекомендуется

Определение предиктора изменений эндометрия PTEN, Ki67

Литература

Онкобелок Р16 (назначается только с позицией 25.112)

Внимание! Исследование выполняется только вместе с услугой 25.112 «Цитологическое исследование соскобов шейки матки, ц/к, влагалища (жидкостная цитология)». Допустимо наличие результата жидкостной цитологии давностью не более 1 месяца.
Исследование на онкобелок Р-16 проводится с целью обнаружения предраковых и раковых изменений шейки матки у женщин.
Рак шейки матки (РШМ) — это второе по распространённости заболевание рака среди женщин, от которого ежегодно умирает более 250 000 женского населения во всем мире.
Факторы риска развития РШМ: нерегулярное обследование, слабый иммунитет, возраст (старше 40 лет), частая смена половых партнеров, курение, длительный приём оральных контрацептивов, частые роды, перенесённая хламидийная инфекция, дефицит витаминов А и С. К особенностям рака шейки матки как нозологической формы относятся медленное развитие (7–15 лет) и возможность выявления на ранней стадии с помощью цитологического исследования мазков с шейки матки.
ВПЧ 16 типа и онкопатология
Вирус папилломы человека (ВПЧ) 16 типа может стать причиной раковых образований. ВПЧ 16 является причиной развития рака шейки матки, наружных половых органов, влагалища, области анального отверстия, а также плоских кондилом. Опасность болезни в том, что её проявления появляются только через пару месяцев после инфицирования.
Для раннего выявления предраковых изменений шейки матки, наряду с определением ВПЧ и цитологических мазков, активно внедряется определение белков р16. Одновременная секреция их (коэкспрессия) свидетельствует о нарушении регуляции клеточного цикла и об онкологических изменениях эпителия шейки матки, вызванных вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска.
Показания
Показаниями для назначения анализа «Онкобелок Р16 (назначается только с позицией 25.112)» в лаборатории «ДНКОМ» являются следующие результаты:

Подготовка
Обследование женщин целесообразно проводить в первую половину менструального цикла, не ранее 5-ого дня. Допустимо обследование во второй половине цикла, не позднее, чем за 5 дней до предполагаемого начала менструации. При наличии патологических изменений, взятие материала проводится в день обращения.
Накануне и в день обследования не рекомендуется выполнять спринцевание влагалища. Не рекомендуется взятие биоматериала на фоне проведения антибактериальной терапии (общей/местной) и во время менструации. За 3 дня до взятия биоматериала следует исключить половые контакты. Если выполнялось интравагинальное УЗИ и кольпоскопия, то сдача соскоба допускается на третий день.
Сбор материала осуществляется до или не ранее 2–3 часов после мочеиспускания.
Интерпретация результатов
Единицы измерения: результат выдаётся в терминах «обнаружено» или «не обнаружено».
Положительный результат исследования является показанием для более тщательного обследования женщины на наличие предраковых поражений шейки матки.

Жидкостная цитология шейки матки и иммуноцитохимическое определение онкомаркера p16ink4a (в мазке эпителия слизистой шейки матки и цервикального канала)

Жидкостная цитология шейки матки является новой стандартизированной технологией приготовления цитологического препарата. На сегодняшний день данный метод является самым информативным в диагностике интраэпителиальных неоплазий. Благодаря новой технологии количество ложных результатов значительно ниже, чем при использовании классических методов цитологического исследования мазка. Это достигается использованием специального стабилизирующего раствора и инструментов для взятия мазка – щеточки cervex-brush.

Жидкостная цитология шейки матки в современной медицине является очень важным исследованием. В настоящее время рак шейки матки занимает вторую позицию по распространенности рака среди женщин и согласно ВОЗ смертность от данной патологии быстро увеличивается.

Для того, чтобы рак шейки матки развился требуется длительное время. От появления интраэпителиальных поражений низкой и высокой степени до возникновения инвазивного рака должно пройти не менее 10 лет. Из этого можно сделать вывод, что у женщины достаточно времени, чтобы диагностировать начальные изменения и начать профилактику. Чаще в клиниках используются классические цитологические исследования мазка – окрашивание биоматериала по Папаниколау и Рар-тест. Эти цитологические методы часто дают ложноотрицательные результаты – до 40 процентов. Это обусловлено неадекватно приготовленным препаратом, нарушениями процедур взятия материала. При использовании жидкостной цитологии шейки матки частота ошибок значительно уменьшается.

Преимущества жидкостной цитологии шейки матки:

  • Отличное качество материала для анализа на цитологию
  • Длительное хранение биоматериала в специальном растворе, что дает возможность его хранить или транспортировать (без разрушения и потери клеток).
  • Приготовление препарата происходит быстро
  • Из одного материал можно приготовить несколько препаратов для анализа на цитологию
  • Методики окрашивания препарата стандартизированы

Таким образом, жидкостной цитологии шейки матки качество цитологического исследования мазка значительно повышается.

Анализ на цитологическое исследование мазка рекомендуется сдавать в качестве скрининга, даже когда симптомов нет. Сдать анализ на цитологию в первый раз следует через 3 года после начала половой жизни, либо при достижении 21 года. Скрининг необходимо проходить ежегодно. Если после 30 лет у женщины три последовательных отрицательных результата анализа на цитологию, то скрининг можно проходить раз в два-три года, но при наличии факторов риска (иммунодефицит, инфицирование ВПЧ) у женщины, ей необходимо анализ на цитологию ежегодно. Также скрининг следует проводить женщинам, у которых была удалена матка, но сохранена шейка матки. Ранняя диагностика при помощи жидкостной цитологии шейки матки позволяет вовремя выявить патологию и предотвратить развитие злокачественной опухоли, путем своевременного адекватного лечения.

Доказано, что ВПЧ (вирус папилломы человека) является фактором, который индуцирует развитие рака шейки матки. Значительно повышает эффективность скрининга определение клеточного протеин p16INK4a. Его экспрессия увеличивается при репликации онкобелков E6 и E7, которые реплицируются при интеграции вируса папилломы человека в генетический материал клеток эпителия шейки матки. В норме данный белок вырабатывает в очень малых количествах, которые нельзя обнаружить. При развитии канцерогенеза эпителия шейки матки это протеин синтезируются в больших количествах и дает возможность оценить дисплазию. Выявление p16INK4a является отличным дополнением к жидкостной цитологии шейки матки, так как совместное их применение позволяет выявить патологию на ранних стадиях развития (особенно CIN II, CIN III и начальные формы рака). Выявление заболевания на данных стадиях развития позволяет излечить пациентку практически в 100%.

ВПЧ-ассоциированные заболевания в практике акушера-гинеколога

Папилломавирусная инфекция, поражающая кожу и слизистую аногенитальной области, — часто встречающаяся патология. По данным ВОЗ, за последние 10 лет заболеваемость ею увеличилась более чем в 10 раз. В развитых странах это самое распространенное заболевание, передающееся половым путем.

Дмитрий Семёнов, доцент кафедры акушерства и гинекологии ВГМУ, доктор мед. наук

В 1983 году немецкий вирусолог Харальд цур Хаузен установил роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии ряда патологий кожи и слизистых, в т. ч. рака шейки матки (РШМ); через 25 лет ему вручили Нобелевскую премию по медицине.

Разные формы папилломавирусной инфекции гениталий встречаются у 42–54% пациенток, обращающихся к гинекологам совсем по другим причинам.
Сексуальные контакты — основной фактор риска; поражение ВПЧ превалирует у молодых (15–25 лет), ведущих активную половую жизнь.

Генитальные типы ВПЧ могут инфицировать шейку матки, влагалище, вульву и перианальную область (в одном либо нескольких отделах репродуктивного тракта). Способны регрессировать, персистировать или прогрессировать.

Надо учитывать, что ВПЧ передается не только половым, но и вертикальным путем (от матери к ребенку во время родов) и становится причиной рецидивирующего респираторного папилломатоза.

В настоящее время идентифицировано более 200 типов ВПЧ, дающих различные клинические проявления в зависимости от локализации и иммунного ответа пациента. Характерно скрытое (латентное) течение. Инкубационный период — от 2 месяцев до 10 лет. Может происходить инфицирование как одним, так и несколькими типами ВПЧ. Экзогенные и эндогенные факторы способствуют активации вируса, а воздействие триггерных помогает ему размножаться (при этом болезнь переходит в стадию продуктивной инфекции).

В некоторых ситуациях (до 30%) за 6–12 месяцев ВПЧ самопроизвольно элиминируется и наступает излечение. В других случаях наблюдается длительное рецидивирующее течение, развиваются интраэпителиальная неоплазия и раковый процесс. Это наиболее характерно для типов ВПЧ, обладающих значительной трансформирующей активностью по отношению к эпителиальным клеткам.

Установлено, что генитальная ВПЧ-инфекция имеет высокую контагиозность и приобретается в первых сексуальных контактах. Заражение при однократном половом акте происходит приблизительно в 60% случаев. Среди ведущих активную половую жизнь в возрасте до 30 лет ВПЧ-инфекция одинаково поражает мужчин и женщин, но у последних вызывает более серьезные нарушения. Так, по данным ВОЗ, в мире ежегодно фиксируется около 600 тысяч эпизодов РШМ.

Несмотря на интенсивное лечение, почти для половины больных прогноз неблагоприятный.

Высокоспецифичные типы ВПЧ вызывают поражения кожи и слизистых половых органов или анальной области в местах трения, травматизации и мацерации кожи. Спектр клинических проявлений генитальной ВПЧ-инфекции варьирует от субклинических форм до РШМ. На данный момент описано несколько вариантов течения болезни:

  • латентное определяется нахождением папилломавируса в базальном слое эпителия. Характеризуется кольпоскопической, цитологической и гистологической нормой; клинической картины нет. ВПЧ-инфекцию выявляют ДНК-методы (ПЦР);
  • продуктивное предусматривает размножение вируса с клиническими проявлениями (папилломы, бородавки, кондиломы);
  • дисплазия (неоплазия) развивается вследствие интеграции ДНК вируса в геном клетки. При неоплазии изменяется структура эпителиальных клеток. Диагноз подтверждается гистологическим обследованием;
  • карцинома — инвазивная опухоль. Вирус существует в клетке в интегрированной форме. При этом выявляются измененные, атипичные клетки — своеобразные маркеры злокачественного процесса.

По трансформирующей активности в отношении эпителиальных клеток все известные папилломавирусы разделены на 2 основные группы:

  • низкого онкогенного риска (ВПЧ 1, 2, 3, 5, 6, 11, 30, 40, 42, 43, 44, 53, 61);
  • высокого онкогенного риска (ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68).

Обнаружить ВПЧ-инфекцию на видимых участках тела несложно. Чтобы поставить диагноз, иногда достаточно простого осмотра. При поражении внутренних половых органов, прежде всего шейки матки, требуется специальная диагностика, выявляющая скрытые формы инфекции и предраковые состояния шейки матки:

  • расширенная кольпоскопия шейки матки;
  • цитологическое исследование мазков;
  • определение ДНК ВПЧ методом ПЦР;
  • гистологическое исследование биоптатов шейки матки.

Благодаря результатам ряда международных и собственных исследований, в клинике ВГМУ разработан алгоритм диагностики и лечения пациенток с ВПЧ-инфекцией, включающий противовирусную терапию, местное применение химических, физических и физиохирургических методов. Если все сделано своевременно, в 100% случаев можно предотвратить РШМ.

Цели лечения — удалить эпителиальные ткани, вовлеченные в патологический процесс, и элиминировать ВПЧ. Наиболее щадящий и эффективный способ избавления от кондилом — химическая цитодеструкция с использованием солкодерма.

Случай из практики. Пациентка А., 19 лет. Обратилась с диагнозом «остроконечные кондиломы промежности и преддверия влагалища».

Гинекологический анамнез: менструации с 12 лет, регулярные, по 3–5 дней через 28 суток, умеренные, безболезненные. Половую жизнь начала в 15 лет, с 18 — в браке. Было 4 сексуальных партнера.

На половых органах появились мелкие бородавчатые образования, которые постепенно увеличивались. К врачу обратилась только через 3 месяца. При осмотре диагностированы экзофитные кондиломы вульвы. Произведена их химическая цитодеструкция.

Через 4 недели экзофитных кондилом нет, состояние удовлетворительное, жалобы отсутствуют.

При субклинической картине и выявлении высокоонкогенных типов ВПЧ целесообразно проводить комбинированное лечение: иммунотерапия плюс (согласно международным рекомендациям) удаление измененного вирусом эпителия.

Случай из практики. Пациентка Б., 27 лет. Гинекологический анамнез: менструации с 13 лет, регулярные, по 4–6 суток через 30–32 дня, умеренные, безболезненные. Половая жизнь с 17 лет, в браке с 19 лет. Муж здоров. Делала аборт в 22 года на малом сроке, обошлось без осложнений.

Гинекологические заболевания: бактериальный вагиноз неоднократно; уреамикоплазмоз в 2009 году, лечилась вместе с партнером.

При обращении жаловалась на отсутствие беременности в течение 2,5 года.

После обследования установлен диагноз: вторичное бесплодие, субклиническая форма ВПЧ, инфекция шейки матки с высокоонкогенным типом ВПЧ, дисплазия шейки матки II ст.

Проведено комбинированное лечение: иммунотерапия и удаление пораженного вирусом эпителия шейки матки.

Спустя 6 недель жалоб нет. В мазке из шейки матки при ПЦР не обнаружено ВПЧ высокоонкогенных типов. Кольпоскопия также не выявила патологии.

Случай Б. интересен тем, что ВПЧ-инфекция протекала бессимптомно, определена при обследовании по поводу вторичного бесплодия, а комбинированная терапия с учетом изменений иммунного статуса позволила добиться выздоровления и элиминации ВПЧ.

Одно из последних достижений науки — создание вакцины от РШМ, а именно против ВПЧ. В ее основе — структурные белки ВПЧ, которые вводятся в качестве антигена. Это безопасно, т. к. вирусные частицы не содержат геном самого вируса и не являются инфекционным фактором. В настоящее время более чем в 85 странах, в т. ч. в Беларуси, зарегистрированы 2 профилактические вакцины: квадривалентная рекомбинантная (6, 11, 16, 18-й типы ВПЧ) компании Merck&Co — «Гардасил»; бивалентная (16-й и 18-й типы ВПЧ) компании GSK — «Церварикс».

Период клинических наблюдений за вакцинированными пациентками составляет более 15 лет. По данным Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), вакцины обладают почти 100% эффективностью против 4 основных разновидностей ВПЧ, заражение которым может привести к злокачественным новообразованиям. В клинике ВГМУ проводится полный комплекс лечебно-диагностических и профилактических мероприятий, направленных на предотвращение РШМ, в т. ч. вакцинация.

Материал рассчитан на врачей-акушеров-гинекологов и онкологов.

Дмитрий Семёнов